PARLONS SCIENCES

CRISPR-Cas, une technique révolutionnaire pour modifier le génome

CRISPR-Cas, une technique révolutionnaire pour modifier le génome
Avec l’avènement du séquençage, sa rapidité et son coût de plus en plus faible, les patrimoines génétiques de très nombreux organismes vivants ont été décryptés. Le génome humain n’y a pas échappé et la lecture complète de ses 3 milliards de lettres s’est achevée en 2003. Aujourd’hui, à peine une dizaine d’années plus tard, le séquençage intégral de n’importe quel ADN d’une taille comparable prend quelques heures et coûte moins d’un millier d’euros. Les applications du séquençage sont très nombreuses : mieux comprendre le fonctionnement des gènes, comparer les espèces entre elles et connaître leurs origines, détecter des variations ou des anomalies génétiques... Dans le domaine de la recherche médicale, le séquençage a permis de mettre en évidence des mutations responsables de maladies génétiques et ainsi de créer des modèles animaux mimant ces pathologies pour mieux les étudier et les soigner. Cependant, les techniques disponibles pour modifier le génome étaient jusqu’à très récemment longues et difficiles à mettre en œuvre. Depuis 2012, les chercheurs disposent d’un nouvel outil moléculaire : le complexe CRISPR-Cas9. Celui-ci permet de modifier à volonté et très rapidement n’importe quel ADN. Son utilisation ouvre de larges horizons dans des domaines aussi variés que la biologie, la génétique, la médecine, l’agriculture, la chimie … Au delà de ses avantages indéniables, sa facilité d’utilisation suscite des inquiétudes quant aux dérives possibles, appelant experts et simples citoyens à un large débat sur le sujet.

 

cc by--sa YourekaScience

Mutations spontanées, induites et sélection

Mutations spontanées, induites et sélection

Thomas Hunt Morgan découvrit que les gènes sont portés par les chromosomes et démontra leur rôle dans l‘hérédité (Prix Nobel de Médecine en 1933). Son élève puis collaborateur, Herman Joseph Muller, montra que l’irradiation des mouches aux rayons X augmentait la fréquence des mutations (Prix Nobel de médecine en 1946). Leur modèle d’étude fut la mouche du vinaigre ou drosophile. via wikipedia. 


Depuis longtemps, et bien avant qu’il sache ce qu’est l’ADN, l’humain a croisé les espèces animales ou végétales pour sélectionner des traits ou caractères qui l’intéressaient (rendement, valeur nutritive, résistance aux maladies,…). La diversité des caractères repose sur l’apparition aléatoire et spontanée de mutations sur l’ADN. Les croisements appropriés ont pour but d’enrichir la population en individus porteurs des traits héréditaires d’intérêt. Les mutations spontanées sont cependant très rares. Herman Joseph Muller fut le premier, dans les années 30, à montrer que les rayons ionisants (type rayons X) augmentaient la fréquence des mutations

A partir des années 1950, cette découverte incita la filière agroalimentaire à irradier les plantes afin de favoriser la diversification génétique. Des mutagènes chimiques produisant des dommages moins importants à l’ADN furent aussi utilisés dans le même but. Aujourd’hui, plus de 3000 variétés de 170 espèces végétales différentes, générées par des traitements provoquant des mutations induites (riz, blé, orge, manioc, bananes...), sont cultivées et consommées1.

 

OGM

 
Qu’elles soient spontanées ou induites, les mutations sont aléatoires, nécessitant souvent des années de recherche pour les localiser dans le génome et étudier leur impact sur le caractère sélectionné. Avec l’avènement du séquençage et du génie génétique, il devint peu à  peu possible de reproduire et modifier le génome des êtres vivants et ainsi d’introduire des mutations et d’en étudier les conséquences. Des organismes génétiquement modifiés (OGM), bactéries, plantes, animaux, ont été développés, possédant dans leur génome une séquence d’ADN étranger (ou transgène), transmissible aux descendants, qui leur conférait de nouvelles propriétés (on parle d’organismes transgéniques). Une grande partie de ces OGM sert à la recherche fondamentale, renseignant sur le fonctionnement des gènes et des mécanismes cellulaires. D’autres OGM sont utilisés pour des applications variées. Par exemple, la bactérie Escherichia coli est utilisée en routine dans les laboratoires de recherche pour construire de nouveaux gènes et synthétiser toutes sortes de protéines  (dont des protéines médicaments) ; des plantes transgéniques (maïs, soja, riz, tomates, aubergines, pommes de terre, etc) résistantes aux insectes, à des herbicides, à des maladies, à la sécheresse ou sources de vaccins… sont régulièrement produites; des souris transgéniques sont réalisées pour développer des modèles de maladies humaines etc. 
 
 
 

Modification ciblée

 
Jusqu’au début des années 90, les techniques d’obtention de plantes ou d’animaux génétiquement modifiés ne permettaient pas d’introduire la séquence d’ADN étranger dans une région précise, laissant craindre un effet délétère de l’insertion aléatoire du transgène. En effet, il pouvait s’intégrer dans un gène ou une région régulatrice importante, provoquant ainsi une dérégulation non programmée de l’expression génique. Ce problème a fait l’objet de très nombreuses études et a abouti au développement de techniques qui permettent d’introduire une séquence d’ADN à l’endroit désiré. La voie a été ouverte par Mario Capecchi, Martin Evans et Oliver Smithies qui ont reçu le Prix Nobel de médecine en 2007. Ils ont utilisé la recombinaison homologue (schéma ci-dessous) dans des cellules souches embryonnaires2 pour insérer le fragment d’ADN de leur choix (transgène) à l’endroit désiré. Ces cellules sont ensuite utilisées pour des souris portant dans leur génome cette modification, transmissible à leurs descendants. 
 
Obtention d’une modification ciblée par recombinaison homologue 
Obtention d’une modification ciblée par recombinaison homologue : Un vecteur de recombinaison (orange) contenant un fragment d’un gène A (boites bleues) muté (étoile jaune) est introduit dans les cellules souches de souris. Le vecteur peut s’intégrer aléatoirement dans le génome cellulaire mais il peut aussi s’apparier au gène cellulaire A et échanger ses séquences par recombinaison homologue (traits verts). La mutation est ainsi introduite dans le génome à l’endroit choisi. cc by-sa Dominique Morello, Muséum de Toulouse
 

L’arrivée des premières nucléases

 
Depuis, plusieurs milliers de souris mutées précisément sur un gène particulier ont été développées, constituant des outils génétiques précieux pour comprendre la fonction du gène correspondant, établir des modèles de maladies génétiques humaines et tester des traitements thérapeutiques. Malheureusement, la fréquence de l’événement de recombinaison étant très faible, l’obtention de telles souris est longue et couteuse. Des améliorations concernant l’efficacité de la stratégie et son extension à d’autres organismes ont été constamment apportées. Citons par exemple l’élaboration de « ciseaux moléculaires » très précis, les nucléases à doigts de zinc (ZFN, pour zinc-finger nuclease) ou encore les méganucléases, TALEN (Transcription activator-like effector nucléases) dont l’utilisation se répand dans les années 2010 ; elles offrent la possibilité de couper la séquence d’ADN exactement à l’endroit choisi et ce dans le génome de nombreux organismes pluricellulaires (tabac, maïs, rat, drosophile, poisson, etc). Ces coupures ciblées de l’ADN permettent ainsi d’inactiver des gènes d’intérêt  mais aussi d’augmenter considérablement les évènements de recombinaison, facilitant ainsi l’intégration du transgène.
 
ciseaux nucléaires
 
Fonctionnement schématique de « ciseaux moléculaires », des nucléases de type TALEN, qui coupent l’ADN très spécifiquement (via systembio.com)
 

Une révolution dans l’ingénierie des gènes : CRISPR-Cas9, un outil universel

 
Mais, là encore des progrès restaient à faire car l’efficacité de ces outils in vivo est variable d’un organisme à l’autre, d’une culture cellulaire à l’autre, d’un gène ciblé à l’autre. De plus, chaque projet scientifique requiert son type d’ « enzymes-ciseaux » spécifiques mais compliquées à synthétiser. Et c’est là qu’entre en scène, en 2012, l’outil révolutionnaire au nom quasiment imprononçable de CRISPR-Cas9.
 
Sans rentrer dans les détails, retraçons brièvement la genèse de son utilisation, une longue suite d’événements a priori très éloignés les uns des autres, qui témoignent de l’importance de la recherche fondamentale. 
 

Quand les bactéries sont douées d’immunité

En 1987, le biologiste japonais Atsuo Nakata découvre dans le chromosome de la bactérie E. coli des séquences d’ADN intrigantes dont l’enchainement des lettres (A, T, G ou C) peut se lire indifféremment dans un sens ou dans l’autre et qu’on appelle palindrome (voir schéma ci-dessous). « Engage le jeu que je le gagne » ou « Ce reptile lit Perec » sont des exemples de palindromes écrits en français. C’est de cette caractéristique que vient leur nom de CRISPR pour Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (en français, courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement interespacées). 
Une séquence d’ADN palindromique :
Une séquence d’ADN palindromique via wikimedia
 
 
Trois ans plus tard, les bioinformaticiens, qui analysent et comparent les séquences d’ADN, découvrent que les fragments d’ADN qui séparent ces palindromes (xxx dans le schéma) ne sont pas d’origine bactérienne mais correspondent à des séquences de virus qui infectent les bactéries, les bactériophages. CRISPR est présent chez environ 50% des bactéries et 90% des archées connues3. En 2007, des chercheurs français de l’entreprise agroalimentaire danoise Danisco s’aperçoivent que les bactéries alimentaires Streptococcus thermophiles qu’ils utilisent pour fabriquer leurs yaourts résistent mieux aux bactériophages quand elles ont des séquences CRISPR que quand elles n’en n’ont pas. Tout se passe comme si la bactérie gardait en mémoire la trace de la première infection virale en incorporant dans son génome un fragment du virus qui l’infecte et qu’elle s’en serve ensuite pour se débarrasser de l’intrus viral déjà rencontré par elle ou par ses ancêtres. 
Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna lors de la remise du Prix Breacktrhough.Et c’est effectivement ce qui se passe comme l’ont démontré Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna dans un article retentissant paru dans la revue Science en Août 20124. Elles y décrivent le mécanisme précis par lequel le virus est éliminé, impliquant une nucléase, la protéine Cas9 (pour CRISPR-associated) et des petits ARN5, synthétisés à partir des séquences CRISPR, servant de guides pour reconnaître la séquence virale et la couper . 
 
Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna lors de la remise du Prix Breacktrhough.E. Charpentier est microbiologiste de formation ; elle travaille à l’Université d’Umea (Suède) et à l’ecole de médecine de Hanovre (Allemagne). J. Doudna est professeure de chimie et biologie moléculaire à l’Université de Californie (Berkeley).
Copie écran article "Jennifer Doudna wins 2015 Breakthrough Prize in life sciences", via Innovative Genomics Initiative
 
Un kit moléculaire précis, simple et universel pour modifier les génomes
Les deux chercheuses ne se sont pas contentées de décortiquer le mécanisme complexe de protection de la bactérie contre l’infection ; elles ont aussi proposé un kit simplifié universel qui marcherait dans n’importe quelle cellule et permettait de modifier à volonté le génome à un endroit précis.
 
cas9
 Le kit de modification (ou « editing » en anglais) contient un ARN « guide » (en bleu sur le schéma ci-dessous) reconnaissant une séquence bien précise du génome (en rouge avec l’étoile jaune) ; il transporte avec lui et ainsi guide, d’où son nom, le ciseau moléculaire Cas9 (la grosse protéine en mauve) à l’endroit ciblé. Une fois coupé, l’ADN peut être réparé ou modifié par insertion d’un fragment d’ADN approprié. via IGTRCN
 
 
A peine quelques mois après la publication de leur article, plusieurs laboratoires travaillant sur des cellules de mammifères (y compris humaines) montraient la justesse de leur proposition et découvraient que le système CRISPR-Cas9 était incomparablement plus efficace, simple et rapide que les techniques précédentes les plus sophistiquées (par exemple seulement 0,5 % des cellules manipulées avec l’enzyme TALEN présentaient le gène correctement modifié contre 8% avec la technique CRISPR-Cas9). Depuis, la technique s’est répandue comme une trainée de poudre et les génomes de très nombreux organismes ont été modifiés (riz, tabac, sorgho, maïs, Arabidopsis thaliana, poisson zèbre, levures, drosophiles, vers ,…). 
 
 

Un champs d’applications immense 

 
Tel un couteau suisse, l’enzyme Cas9 a été utilisée pour remplir de nombreuses fonctions : modifier les séquences d’un ou de plusieurs gènes simultanément pour les inactiver ou au contraire les réparer; repérer la localisation de séquences d’ADN particulières en inactivant Cas9 et la couplant à un marqueur fluorescent. La technique n’a de restriction, pour l’instant, que l’imagination des chercheurs qui l’utilisent. 
Les biologistes cherchent également à améliorer la technique, notamment pour éviter les erreurs de ciblage et augmenter son efficacité. Dans cette optique, Feng Zhang et ses collègues (Broad Institute de Cambridge, Massachusetts, USA) ont remplacé Cas9 par une autre enzyme bactérienne de fonction similaire, Cpf1. Cette enzyme forme avec l’ARN guide un complexe plus petit qui pénètre plus facilement dans les cellules ou les tissus et qui semble encore plus précis que le complexe CRSPR/Cas9.
La recherche médicale n’est pas en reste et les exemples d’utilisation de la technique CRISPR/Cas9 sont de plus en plus nombreux. Citons par exemple les travaux effectués chez la souris par l’équipe de Tyler Jacks et Daniel Anderson (MIT, USA) qui a corrigé une maladie génétique incurable du foie, la tyrosinémie, ou encore, plus récemment, les recherches publiées simultanément par 3 équipes (dans le numéro du 1er janvier de la  revue Science) sur la guérison de souris modèles de la myopathie de Duchenne, une dégénérescence  musculaire qui touche 1 garçon sur 5000. Leurs résultats laissent penser qu’on pourrait utiliser CRISPR-Cas pour « réparer » des patients ainsi affectés. Mais d’importantes améliorations techniques sont nécessaires avant de passer aux essais cliniques. En 2014, les premiers primates (Macaca fascicularis) portant 2 gènes modifiés par cette technique sont obtenus à l’université médicale de Nankin (Chine) 6.
 
 

Jusqu’où peut-on aller ?

 
  La puissance de l’outil commence à inquiéter. Si l’on admet facilement la possibilité de réparer un gène défectueux chez un individu malade, est-on prêt à accepter de modifier le génome d’un enfant à naître ? Si de telles interventions sont inenvisageables en France, qu’en est-il dans les autres pays ? En avril 2015, une équipe chinoise s’est servie de CRISPR-Cas9 pour modifier le génome d’embryons humains, contrevenant à la convention d’Oviedo ratifiée par 28 pays européens, dont la France en 2011. Les biologistes de l’équipe de Junjiu Huang (université de Sun-Yat-sen, Canton) ont travaillé sur des embryons humains non viables (car porteurs de chromosomes surnuméraires) et ont testé leur capacité à corriger une maladie redoutable du sang, la b-thalassémie. Même si une faible fraction seulement des 80 embryons traités avec le kit CRISPR-Cas9 a été corrigée, nul doute que, la technique s’améliorant constamment, le pourcentage de réussite ira croissant. Modifier le génome d’un embryon humain, c’est par définition modifier le génome de ses futures cellules sexuelles (spermatozoïdes ou ovocytes) et ainsi transmettre la modification apportée à sa descendance potentielle. C’est, comme le formulent déjà certains, la porte ouverte à l’eugénisme.  
Les Académies des Sciences de plusieurs pays (Angleterre, Chine, France, USA) se sont réunies à Washington début décembre 2015 pour débattre de l’utilisation biomédicale de CRISPR-Cas9. Elles ont reconnu la puissance et la facilité d’utilisation de cet outil pour traiter un grand nombre de pathologies d’origine génétique ou virale. Mais elles ont aussi noté que des améliorations techniques considérables étaient encore nécessaires avant d’envisager  des essais cliniques. Ce qui pose le plus de questions n’est pas tant de modifier le génome des cellules somatiques (cellules musculaires, du sang, du foie…) que de modifier les cellules germinales et, partant, la descendance à venir et ainsi orienter l’évolution de l’espèce humaine. Alors il est temps que non seulement les experts scientifiques et les spécialistes médicaux mais aussi l’ensemble de la société s’emparent de la réflexion, débattent et participent aux décisions. 
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Article de synthèse rédigé par Dominique Morello, chercheuse au CNRS détachée au Muséum de Toulouse. Mis en ligne le 1er février 2016. 
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1- Améliorer les variétés de bananes, IAEA Bulletin 52-2-2011, chapitre 6 : Sciences nucléaires
2- Cellules souches et thérapie : mythe ou futur proche ? Dominique Morrello. Parlons Sciences, Muséum de Toulouse, 2 février 2015. 
4- Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829. Epub 2012 Jun 28.
A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Jinek M1, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E.-
5- ARN : Acide Ribo Nucléique, une molécule très proche chimiquement de l’ADN mais qui généralement comporte un seul brin 
6-Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos. Yuyu Niu7, Bin Shen7, Yiqiang Cui7, Yongchang Chen7, Jianying Wang, Lei Wang, Yu Kang, Xiaoyang Zhao, Wei Si, Wei Li, Andy Peng Xiang, Jiankui Zhou, Xuejiang Guo, Ye Bi, Chenyang Si, Bian Hu, Guoying Dong, Hong Wang, Zuomin Zhou, Tianqing Li, Tao Tan, Xiuqiong Pu, Fang Wang, Shaohui Ji, Qi Zhou, Xingxu Huang, Weizhi Ji, Jiahao Sha
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